Im Jahre 1251 findet der St. Nikolaihof das erste Mal urkundliche Erwähnung als „Haus der armen Kranken“. Aus Angst vor Ansteckung brachte man zu der Zeit die an Lepra Erkrankten außerhalb der Stadtmauern Lüneburgs im Nikolaihof unter. Nachdem Lepra im 16. Jahrhundert unter Kontrolle war, wurde der St. Nikolaihof als Altenheim genutzt.
Die Kapelle war das Gründungsgebäude des Hofes und wurde im Jahr 1310 errichtet. Im frühen 14. Jahrhundert entstand das Alte Männerhaus, das Provisorat im 16. Jahrhundert, das Neue Männerhaus und das Organistenhaus im 17. Jahrhundert sowie das Frauenhaus im 18. Jahrhundert. Gemeinsam prägen diese Gebäude das Gesamtensemble, welches sich im Eigentum der Stiftung Hospital St. Nikolaihof befindet.
Für die Jahre 1410 bis 1466 existiert ein umfangreiches Rechnungsbuch über St. Nikolaihof, geführt vom Lüneburger Ratsherren Hinrik Lange, der das Altenheim verwaltete. Daraus lässt sich erkennen, dass vierzig Männer und Frauen die Kammern im Männer- und Frauenhaus bewohnten.
Weitere vierzig Personen, Knechte, Mägde, Viehhirten, dazu Küster, Organist, Pastor und Hofmeister arbeiteten hier.
Es gab reichliche Einnahmen aus Anteilen an Lüneburger Salzpfannen, aus Grundstücken und Häusern, aus der Badestube, Fischbänken, Almosenständen, der Pacht des Bardowicker Schleusenmeisters, aus dem Verkauf von Korn, Eiern, Vieh, Fellen, Leder und Wolle.
Die wirtschaftlichen Verhältnisse waren so gut, dass Verwalter Hinrik Lange die Anlage gründlich renovieren lassen konnte. So wurde der Wirtschaftshof gepflastert, eine neue Umzäunung bis um den anschließenden Eichhof geführt, die Waschstege an der Ilmenau wurden befestigt. Für das fortschrittliche „pishuse“, den Abtritt, wurde eine Flusswasserleitung gelegt.
1435 ließ Ratsherr Lange die Backstein-Kapelle umbauen. Die Außenmauern des einschiffigen Saales wurden erhöht, die Fenster vergrößert und wahrscheinlich ein neuer, polygonaler Chor angebaut. Für den Dachstuhl über dem neuen Gewölbe wurden Balken des alten Daches wieder verwendet. Durch dendrochronologische Untersuchungen konnte das Fälldatum der älteren Hölzer auf 1310 festgelegt werden. Kurz danach wird also die alte Kapelle errichtet worden sein. Die jüngeren Hölzer wurden in den Jahren 1431-34 gefällt. Der Turm war bereits im ersten Viertel des 15. Jahrhunderts angebaut worden.
Im Mai 1436 weihte der Verdener Bischof die umgebaute Kapelle mit drei Altären. 1441 stiftete Hinrik Lange noch einen Altar. 1445 wurde an der Südseite eine Sakristei angebaut. Die Orgel, deren vorn sichtbare Pfeifen 1436 gegossen wurden, kaufte Lange von der Johanniskirche in Lüneburg.